La tecnica denominata PCR (acronimo di Polymerase Chain Reaction) è una delle più note e fondamentali tecniche della biologia molecolare. Fu ideata nel 1983 da Kary B. Mullis, che per essa ricevette il premio Nobel per la chimica appena dieci anni dopo. Oggi entra a far parte di pressoché ogni esperimento scientifico in ambito biologico, in una miriade di campi diversi: ricerca, diagnostica microbiologica, caratterizzazione di cellule tumorali, paleontologia, medicina forense, ingegneria genetica e tante altre. Ve ne sono alcune varianti, così come diversi sono gli strumenti grazie ai quali viene eseguita, i termociclatori.
Standard PCR
Lo scopo di questa metodica è essenzialmente quello di “amplificare”, ossia aumentare esponenzialmente, una piccola quantità iniziale di una molecola di acido nucleico (DNA o RNA) fino ad ottenerne abbastanza da poter eseguire successive analisi. Gli acidi nucleici si ottengono da diverse fonti (nuclei o mitocondri di cellule eucariote, nucleoidi di cellule procariote, virus, ecc.) tramite protocolli di estrazione che consentono di separarli da tutte le altri componenti della cellula.
Una volta ottenuta, in soluzione acquosa, la corretta quantità di acido nucleico vengono aggiunti i reagenti necessari per la reazione di PCR. Questa avviene fisicamente all’interno di piccole provette sterili in plastica, che a seconda del modello possono avere un volume variabile tra 0,2 e 0,5 ml. La particolarità di queste provette è avere delle pareti dallo spessore molto fine e soprattutto costante, di modo da permettere una omogenea penetrazione del calore.
Ogni provetta contiene un differente campione e ad ogni utilizzo un termociclatore ne può ospitare alcune decine allo stesso momento. La piastra metallica che viene fisicamente scaldata e raffreddata secondo il protocollo desiderato possiede infatti numerosi alloggi. Essi sono detti “pozzetti”, il cui numero e grandezza possono variare da un modello all’altro. Il campione, una volta inserito nel termociclatore, andrà incontro a tre fasi che si susseguono ciclicamente, ognuna delle quali è caratterizzata da specifiche reazioni enzimatiche ed avviene ad una temperatura ben precisa.
Fasi della PCR
Lo strumento con cui si esegue la PCR è chiamato “termociclatore” proprio perché è in grado di condurre le tre variazioni di temperatura consecutive necessarie per l’amplificazione enzimatica del campione per un numero di ripetizioni (“cicli”) stabilito dallo sperimentatore. Le tre fasi di una PCR eseguita su un campione di DNA a doppio filamento sono tipicamente: denaturazione, annealing e allungamento.
Questa serie di cicli si ripete diverse volte (fino a 30-40) e permette di ottenere una quantità veramente considerevole di DNA a partire da pochissime molecole.
Denaturazione
Prevede che il doppio filamento di DNA di partenza si denaturi, scomponendosi nei due singoli filamenti. Questo processo è reso possibile da un’alta temperatura, in genere tra i 94 e i 99°C.
Annealing
Caratterizzata dalla temperatura più bassa di tutto il ciclo. Permette a brevi sequenze di DNA “artificiale”, i primer, di legare le corrispondenti molecole del DNA da amplificare. I primer sono costruiti ad hoc in base alla sequenza da trovare e amplificare nel campione e fungono da punto di partenza per la DNA Polimerasi, l’enzima che materialmente aggiunge nucleotidi per formare nuove molecole di acido nucleico.
La temperatura in questa fase è mantenuta ad un valore preciso, solitamente situato tra i 50 e i 55°C e scelto in base alle sequenze dei primer, che al crescere della ricchezza in coppie Guanina-Citosina richiederanno una temperatura maggiore. Essa deve essere sufficientemente bassa da consentire la formazione di legami tra i primer e il DNA, ma contemporaneamente abbastanza alta perché questo appaiamento sia specifico e non interessi altre sequenze.
La temperatura di annealing, dunque, non è solo quella con la maggiore variabilità tra un esperimento e l’altro, ma rappresenta anche quella da scegliere con maggiore attenzione, poiché è fondamentale per la corretta riuscita dell’esperimento. Nonostante siano state elaborate diverse tecniche di calcolo manuale, oggi esistono molti software che rendono la progettazione dei primer e il calcolo della loro temperatura di annealing molto più accurata.
Allungamento
Vede l’attività enzimatica della TAQ Polimerasi per la sintesi di nuovo DNA. Questa DNA Polimerasi è un enzima altamente termostabile poiché derivante da un batterio abituato a condizioni di altissima temperatura (Thermus aquaticus). L’introduzione di questa polimerasi ha sostituito nell’uso il precedente Frammento di Klenow, una parte della DNA polimerasi di Escherichia coli che non potendo resistere alle alte temperature della PCR doveva essere aggiunto nuovamente ad ogni ciclo). Ciò ha reso questa tecnica ancora più efficiente. La temperatura è solitamente di 72°C, alla quale si raggiunge la massima efficienza dell’enzima.
Varianti principali della PCR
Sebbene la tecnica standard rimanga quella più utilizzata nella routine di laboratorio, sono state elaborate diverse tecniche per far fronte a nuove esigenze e problemi.
Reverse Transcription PCR (rt-PCR)
Con questa tecnica è possibile ottenere una grande quantità di DNA a partire da RNA a singolo filamento. Questo è importantissimo per lo studio del trascrittoma, ossia quella parte di genoma che viene effettivamente utilizzato da una cellula e che differisce tra un tipo cellulare e l’altro. La differenza principale con la standard PCR è innanzitutto il materiale di partenza, in questo caso RNA piuttosto che DNA, e il fatto che nel processo di amplificazione viene utilizzato un enzima particolare chiamato Trascrittasi inversa. Questo enzima consente la sintesi di un filamento di DNA utilizzando come stampo un filamento di RNA. Le reazioni avvengono nel termociclatore standard, poiché l’unica differenza sostanziale consiste negli enzimi utilizzati.
Real-Time PCR (qPCR)
Questa tecnica costituisce uno sviluppo della PCR standard ed ha avuto grande impatto sulla comunità scientifica. Essa permette di quantificare con grande precisione la quantità di DNA presente in un campione. Si sfruttano diversi metodi che permettono di produrre all’interno del campione una fluorescenza proporzionale alla quantità di DNA. È possibile usare molecole fluorescenti che si intercalano tra le basi azotate del DNA (SYBR Green™) oppure delle sonde coniugate a fluorofori (sonde TaqMan™ e Molecular Beacons).
Misurando quindi l’intensità di fluorescenza e confrontandola con valori di riferimento detti curva standard di calibrazione si riesce ad ottenere la quantità assoluta di DNA. In questa metodica si usa un termociclatore specifico, che integra la funzione di amplificazione del DNA propria della PCR a dei sensori che misurano la fluorescenza. Una piccola nota riguardante la nomenclatura: sebbene l’abbreviazione corretta di questa tecnica sia qPCR, per via dell’utilizzo molto maggiore rispetto alla Reverse-Trasncription PCR, è frequente che ci si riferisca ad essa come rt-PCR.
Digital PCR (dPCR)
Una tecnica molto recente ma che sta iniziando a prendere piede per via dell’altissimo grado di precisione è la Digital PCR. A differenza delle altre reazioni di PCR, che avvengono in un’unica soluzione, nella digital PCR abbiamo la ripartizione della soluzione madre in decine di migliaia di minuscole soluzioni del volume di qualche nanolitro. In ogni micro-soluzione avviene una reazione di PCR separata dalle altre. La lettura di ogni soluzione è binaria, e consiste quindi nella presenza o nell’assenza di segnale fluorescente, prodotto con le stesse metodiche della real time PCR.
Attraverso metodi statistici si può ottenere una stima precisa della concentrazione delle molecole nella soluzione iniziale. Questa tecnica è ideale per, ad esempio, quantificare mutazioni o alleli presenti in bassissime quantità in una mistura di DNA dove un altro allele è invece predominante. Anche in questo caso, per potere eseguire una digital PCR, è necessario un termociclatore apposito.
Caratteristiche dei termociclatori
Nel valutare l’acquisto di un termociclatore piuttosto che un altro sono molti i parametri cui dare attenzione. È importantissimo avere ben chiaro in mente l’uso che se ne dovrà fare in laboratorio, per potersi orientare facilmente tra le caratteristiche dei vari modelli.
Dimensioni
È importante valutare lo spazio disponibile per il proprio strumento. La maggior parte dei termociclatori si presenta in dimensioni relativamente contenute (26×41.5x37cm ad esempio). Sebbene vi siano anche versioni estremamente ridotte (7.1×12.1×4.7cm) o al contrario più voluminose (66x56x66cm). In generale i macchinari per la PCR standard hanno dimensioni ridotte rispetto a quelli per Real-Time o Digital PCR.
Multiwell e volume dei campioni
In base alla natura dei campioni da sottoporre a PCR è importante scegliere il termociclatore adatto. La maggior parte presenta una piastra, detta comunemente “multiwell”, dall’inglese, da 96 pozzetti. Sebbene non siano rari anche i termociclatori con piastre da 384 pozzetti o piastre intercambiabili. A seconda della piastra utilizzata i campioni dovranno avere diversi volumi, in generale 10-100µl per le multiwell-96 o 5-20µl per le multiwell-384.
Temperature accurate ed uniformi
Non bisogna scordarsi che la funzione del termociclatore è quella di far compiere ai campioni una serie di cicli a determinate temperature. L’efficienza e la precisione con cui avvengono i cambi di temperatura è cruciale nella riuscita degli esperimenti e nella loro ripetibilità. Parametri da andare ad osservare sono l’uniformità di temperatura tra un campione e l’altro, e la velocità di riscaldamento e raffreddamento, ossia il tempo necessario a passare da una temperatura ad un’altra. Una funziona essenziale, che ormai si ritrova nella stragrande maggioranza dei prodotti, è il coperchio riscaldato. Esso serve ad evitare che vi siano differenze tra il fondo del tubo contenente il campione e la parte superiore. Questo infatti porterebbe la soluzione a evaporare con conseguente riduzione del volume effettivo di reazione.
Qualità e assistenza
Può sembrare strano, ma nell’acquistare uno strumento di laboratorio, nel caso specifico un termociclatore, molte delle considerazioni da fare sono assolutamente identiche a quelle che si fanno a proposito dell’acquisto di un elettrodomestico, di un auto, di un computer. La qualità del prodotto può essere più o meno buona, per esempio, e durare quindi più o meno tempo. Nell’arco di anni, inoltre, è inevitabile qualche intoppo, ed affidarsi a produttori con un servizio clienti efficiente può essere senz’altro un fattore da considerare.
Costi
Ovviamente, un fattore di cui non si può fare a meno è quello del costo dello strumento. I prezzi sono estremamente variabili e dipendono oltre che dal tipo di PCR che dobbiamo eseguire, da tutte le funzionalità aggiuntive delle quali abbiamo parlato. Un termociclatore standard costa mediamente 3-4000€, mentre un termociclatore per Real-time PCR parte in genere dai 10-15000€ fino a cifre ben più alte. Anche per la digital PCR si parla di costi ben più elevati rispetto allo strumento standard.
Non bisogna fermarsi però soltanto al prezzo iniziale dello strumento. È da considerare anche il costo delle singole amplificazioni. Alcuni prodotti, detti a “sistema chiuso”, ad esempio supportano soltanto determinati kit di reazione, forniti per lo più dalla stessa ditta produttrice del termociclatore, e che alla lunga costituiranno una spesa notevole. Altri strumenti invece funzionano allo stesso modo con dei kit compatibili venduti a prezzi minori.
Tantissimi esperimenti passano attraverso l’esecuzione della PCR e il mercato si è adeguato con la produzione di tantissimi modelli di termociclatore, con le funzionalità più varie, per soddisfare le diverse esigenze dei laboratori di ricerca, analisi e non solo.
Collegamenti esterni
Modelli di termociclatore a confronto – labome.com
Termociclatori standard – biocompare.com
