Ricombinazione V(D)J

I linfociti B e T producono recettori specifici per l’antigene solo dopo il riarrangiamento del DNA che porta alla fusione casuale di segmenti genici denominati V (variable), D (diversity), J (joining). Questa fusione casuale è denominata ricombinazione V(D)J, avviene in qualsiasi locus per le Ig o per il TCR e prevede la scelta casuale di un gene V, un segmento J ed un segmento D (lì dove è presente); la loro unione formerà un singolo esone per la regione variabile di un recettore dell’antigene.

Organizzazione dei geni delle Ig e del TCR

L’organizzazione dei geni per i loci Ig e del TCR è fondamentalmente simile in tutte le cellule ed è caratterizzata dalla segregazione spaziale di numerose sequenze codificanti per i domini variabili ed un numero relativamente basso per le sequenze codificanti le regioni costanti.

Organizzazione dei loci genici per le Ig

Tre loci separati codificano rispettivamente per tutte le catene pesanti H, le catene leggere di tipo κ e quelle di tipo λ delle Ig.

All’estremità 5′ di ciascun locus per le Ig è presente un cluster di geni V (ognuno dei quali di circa 300bp). A monte di questi cluster sono presenti il promotore ed una sequenza Leader (L), essenziali per la trascrizione in mRNA e la traduzione del polipeptide nascente.

A distanza variabile, in posizione 3′ rispetto ai geni V, si trovano i segmenti genici J (lunghi circa 30-50bp) strettamente associati alla regione che codifica per la regione costante.

Tra i geni V e J, nel locus della catena H, si trovano le sequenze codificanti per i segmenti D, questi sono presenti unicamente nelle catene pesanti e del tutto assenti nelle catene leggere.

Ogni locus per le Ig subisce un proprio riarrangiamento che coinvolge un certo numero di geni della regione C. Nell’uomo le catene leggere κ e λ hanno rispettivamente 1 e 4 geni C mentre la catena pesante ha 9 geni C localizzati in modo tale da codificare per i diversi isotipi e sottotipi degli anticorpi.

Sono inoltre presenti elementi regolatori che agiscono in cis come ad esempio gli enhancer (enh) ed i silencer.

Organizzazione dei loci genici per il TCR

Ciascun locus codificante per il TCR presenta un’organizzazione molto simile ai loci codificanti per le Ig. Ogni locus è formato da un cluster localizzato al 5′ composto da numerosi segmenti genici V, seguiti dai segmenti genici D (solo per quanto riguarda le catene β e γ) e da un cluster di segmenti genici J anche qui tutti a monte dei geni della regione C.

I loci γ e δ possiedono nel complesso un numero inferiore di segmenti genici rispetto ai loci α e β. A monte di ogni segmento genico V c’è un esone che codifica per un peptide leader e a monte di ogni esone leader c’è un promotore per ogni gene V.

Nelle catene β e δ il dominio V (della proteina) è codificato dai segmenti genici V, D, e J; mentre nelle catene α e γ il dominio V è codificato dai soli segmenti genici V e J.

Nell’uomo esistono 2 geni C in ciascuno dei loci per la catena β e γ ed un solo gene C per le catene α e δ. Ciascuna regione C è formata da 4 esoni codificanti per il dominio immunoglobulinico della regione extracellulare C, una regione cerniera, il segmento transmembrana e la coda citoplasmatica.

Ricombinazione V(D)J

Il processo di ricombinazione V(D)J che avviene in qualsiasi locus per le Ig e del TCR prevede la scelta casuale di un gene V, un segmento J ed un segmento D (lì dove è presente) ed il loro successivo riarrangiamento a formare un singolo esone V(D)J che codificherà per la regione variabile di un recettore per l’antigene specifico per ogni singolo linfocita.

Nei loci per la catena leggera delle Ig e per le catene α e δ del TCR (entrambe mancanti dei segmenti D) un singolo evento di riarrangiamento unisce casualmente un gene V ad un segmento J; per la catena pesante delle Ig e per le catene β e γ (dove sono presenti i segmenti D) avvengono due distinti eventi di riarrangiamento che devono avvenire separatamente: il primo evento ricongiunge un segmento D and un segmento J mentre il secondo evento ricongiunge il neoformato segmento DJ a un segmento V.

Perchè questo accada in primo luogo la cromatina deve essere aperta in regioni specifiche del cromosoma e successivamente i due segmenti genici devono essere avvicinati (a volte anche da posizioni cromosomiche molto distanti). Quindi alle terminazioni codificanti dei due segmenti genici devono essere effettuati dei tagli alla doppia elica del DNA dove verranno inseriti dei nucleotidi. Infine le terminazioni così processate vengono ricongiunte a formare il gene per il recettore. Le regioni C si posizionano a valle degli esoni V(D)J neoformati.

Sequenze che orchestrano la ricombinazione

Le proteine responsabili del processo di ricombinazione agiscono riconoscendo specifiche sequenze di DNA definite sequenze segnale della ricombinazione (Recombination Signal Seqences, RSS), localizzate all’estremità 5′ dei segmenti genici V, all’estremità 3′ dei segmenti J e ai due estremi dei segmenti D.

Le RSS sono costituite da una sequenza altamente conservata di 7 nucleotidi (CACAGTG) definita eptamero e localizzata vicino alla sequenza codificante, seguita da uno spaziatore di 12 o 23 nucleotidi non conservati e da una seconda sequenza altamente conservata di 9 nucleotidi (ricchi in AT) definita nonamero. Gli intervalli di 12-23 nucleotidi corrispondono rispettivamente ad uno e due giri completi di elica del DNA.

Durante la ricombinazione vengono effettuati dei tagli nella doppia elica tra l’eptamero delle RSS e le sequenze V, D o J adiacenti. Il frammento di DNA a doppia elica tagliato, che contiene le parti terminali dei segnali, viene rimosso sotto forma di anello, permettendo quindi alle estremità dei segmenti genici codificanti di congiungersi. Il riarrangiamento può avvenire per delezione (in media preponderante) o inversione di queste sequenze.

La ricombinazione si verifica soltanto se uno dei due segmenti è affiancato da uno spaziatore di 12 nucleotidi  e l’altro da uno di 23 nucleotidi, definendo così la cosiddetta “regola 12/23“.

In tutto ciò avverrà sempre prima la ricombinazione D-J e solo successivamente la ricombinazione V-DJ. Una delle conseguenze della ricombinazione è che le sequenze promotrici localizzate al 5′ dei geni V vengono portate in contiguità a sequenze enhancer situate a valle, negli introni J-C e al 3′ dei geni della regione C.

Meccanismi della ricombinazione

Il riarrangiamento dei geni per le Ig e per il TCR rappresenta una particolare forma di ricombinazione non omologa regolata dall’attività di diversi enzimi alcuni dei quali si ritrovano solo nei linfociti in corso di maturazione, mentre altri sono presenti in tutte le cellule e spesso coinvolti in meccanismi di riparo del DNA.

In questo processo si possono distinguere ben 4 eventi che avvengono in ordine sequenziale:

1. Sinapsi: due distinti segmenti genici codificanti e le loro RSS adiacenti vengono posti in contatto grazie alla formazione di struttura ad anello e vengono mantenuti in questa posizione per tutti i successivi eventi.
2. Taglio: vengono fatti dei tagli a doppia elica tra le RSS e le sequenze codificanti grazie a specifici enzimi. Due proteine (specifici per la linea linfoide) intervengono in questo processo e sono geni attivanti la ricombinazione 1 e 2 (Recombination-Activating Gene 1 and 2, RAG1 e RAG2) che si assemblano a formare un complesso contenente due molecole di ciascuna proteina, conosciuto anche come ricombinasi V(D)J. Questo complesso agisce come un’endonucleasi di restrizione: RAG1 diventa enzimaticamente attiva solo quando complessato con RAG2, a questo punto riconosce e taglia le sequenze di giunzione tra eptameri e segmenti genici codificanti. La terminazione 3′-OH dell’estremità codificante generata si lega covalentemente all’altro filamento di DNA formando una struttura a forcina (hairpin).
3. Apertura delle hairpin e processamento: le strutture hairpin devono essere aperte e questo avviene grazie ad Artemis che è un’endonucleasi, il taglio che attua non è preciso e può rimuovere parte dei nucleotidi della sequenza codificante. Una volta aperte le hairpin interviene un enzima specifico per i linfociti noto come deossinucleotidiltransferasi terminale (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) che aggiunge in modo del tutto casuale circa 20 nucleotidi (definiti nucleotidi N), così facendo si aumenta ancora di più la diversificazione tra i vari recettori linfocitari.

   

4. Unione: il processo di riparazione delle rotture del doppio filamento andrà a ricongiungere le estremità codificanti processate e gli enzimi che intervengono in questo processo sono in genere ubiquitari. Ci sono Ku70 e Ku80 che ricongiungono le terminazioni di DNA e reclutano la subunità catalitica dell’enzima DNA-PK in grado poi di riparare la doppia elica. Infine la ligasi IV riunirà le estremità.

   

    

Fonti: Abul K. Abbas, ottava edizione, Immunologia cellulare e molecolare, edra