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Retrotrascrizione

La tecnica di retrotrascrizione permette la sintesi di una molecola di DNA a singolo filamento, chiamato complementare (cDNA), a partire da una di RNA utilizzata come stampo. Gli studi di espressione genica, solitamente, partono con l’estrazione dell’RNA e particolare interesse è rivolto all’RNA messaggero. Poi il filamento di RNA viene retrotrascritto in DNA per procedere con la tecnica di PCR.

Amplificazione di molecole di RNA

La molecola di RNA è la protagonista in studi di trascrittomica, disciplina che analizza l’espressione dei geni valutando la presenza dei loro diversi trascritti. Alcuni di essi porteranno poi alla conseguente sintesi di proteine.

Partendo dall’RNA è possibile eseguire la tecnica di PCR introducendo prima di essa una fase di retrotrascrizione che permette di ottenere un filamento di DNA complementare partendo dall’RNA estratto dal campione di partenza.

La trascrittasi inversa

La tecnica di retrotrascrizione è resa possibile grazie all’utilizzo di un enzima specifico, la trascrittasi inversa, che partendo da una molecola di RNA stampo genera una molecola di DNA complementare (cDNA). Questo enzima è una particolare DNA polimerasi, detta RNA-dipendente. La trascrittasi inversa è stata scoperta da Howard Temin e da David Baltimore. Entrambi nel 1975 hanno ottenuto il premio Nobel per la Medicina, in condivisione con Renato Dulbecco. La trascrittasi inversa è utilizzata dai retrovirus durante il processo di infezione, per convertire le proprie molecole di RNA genomico a singolo filamento in molecole di DNA a doppio filamento affinché il genoma virale possa integrarsi nel genoma dell’ospite.

La reazione di retrotrascrizione

La reazione di retrotrascrizione (RT) è utilizzata in laboratori di biologia molecolare per la conversione di RNA in molecole di DNA utili a diverse tecniche di analisi dell’espressione genica, ad esempio la PCR o il clonaggio molecolare. Il DNA complementare è, rispetto all’RNA, una molecola più stabile e meno sensibile alla degradazione. Inoltre, il cDNA di uno specifico gene si differenzia da esso poiché è privo di introni, che sono stati rimossi durante la maturazione del pre-mRNA in mRNA (in particolare durante lo Splicing).

La reazione catalizzata dalla trascrittasi inversa necessita, oltre al filamento di RNA stampo, di deossiribonucleotidi trifosfati (dNTPs), primer, una soluzione tampone e, come per la reazione di PCR, magnesio. I primer rappresentano l’innesco per l’enzima: possono legare in maniera casuale le molecole di RNA (Random Hexamer Primer), oppure possono legare in maniera specifica la coda di poli-A della moelcola di mRNA (Oligonucleotide Primer di Poli-T).

I primer legano le sequenze complementari del filamento di RNA, poi l’enzima estende le sequenze andando a formare il cDNA sulla base del filamento di RNA utilizzato come stampo. Dopo aver ottenuto il cDNA è possibile determinare la quantità di specifici trascritti utilizzando, ad esempio, la tecnica di PCR.

Retrotrascrizione: protocollo

Dopo aver eseguito l’estrazione dell’RNA totale della cellula (cioè tutti i tipi di RNA presenti) e aver purificato il campione ottenuto mediante l’utilizzo di DNasi, allontanando così residui di DNA genomico, è possibile procedere con la quantificazione dell’RNA. Solitamente la reazione di retrotrascrizione è svolta in 20 μL contenenti 1 μg di RNA, ma è bene sottolineare che volumi e quantità dipendono dal kit che si sceglie di utilizzare. Alla reazione viene aggiunto l’enzima e il buffer di reazione, contenente il primer utile all’innesco della reazione e la miscela di dNTPs.

Una volta preparata la reazione questa viene inserita nel termociclatore e si procede con il ciclo di reazione che solitamente è rappresentato da una prima incubazione di 5 minuti a 25 °C, poi da una seconda incubazione di 20/60 minuti a 42/46 °C e poi da un’ultima incubazione di 1/5 minuti a 90/85 °C. Al termine del ciclo si ottiene il cDNA che può essere conservato a + 4 °C se il campione deve essere utilizzato in breve tempo, altrimenti è preferibile conservarlo a – 20 °C.

Un esempio

Di seguito sono esposti i dettagli tecnici di uno dei protocolli comunemente utilizzati per la sintesi del cDNA. Il kit iScript™ cDNA Synthesis della Bio-Rad è intuitivo e semplice da utilizzare. I componenti del kit sono il buffer di reazione (5x iScript Reaction Mix) e l’enzima (iScript Reverse Transcriptase). La reazione viene eseguita in 20 μL finali: in questi 20 μL sono contenuti, seguendo il protocollo del kit, 4 μL di buffer e 1 μL di soluzione contenente l’enzima; i restanti 15 μL contengono l’RNA. È preferibile retrotrascrivere 1 μg di RNA, eventuali diluizioni vengono eseguite utilizzando acqua Nuclease-free, fornita anch’essa dal kit.

Ma vediamo passo dopo passo i semplici passaggi da eseguire.

I nostri reagenti sono conservati a – 20 °C, l’RNA è conservato a – 80 °C, quindi la prima cosa da fare è scongelare i nostri reattivi. Ricordiamo sempre che l’RNA è una molecola che si degrada facilmente, soffre le alte temperature, proprio per questo vogliamo “trasformarla” in cDNA, quindi bisogna fare attenzione a lavorare rapidamente mantenendo i nostri campioni al fresco (utilizzando del ghiaccio ad esempio). Gli strumenti e i materiali da utilizzare sono essenzialmente micropipette, puntali, eppendorf o strip (e non dimenticate guanti e camice!).

L’RNA è stato precedentemente quantificato e opportune diluizioni saranno state fatte affinché ne venga retrotrascritto 1 μg all’interno della nostra reazione. Il buffer e l’enzima dovranno essere dolcemente agitati prima dell’utilizzo. Solitamente le reazioni di retrotrascrizione vengono eseguite per più campioni, è possibile preparare un’unica mix contenente il buffer e l’enzima,  e poi dispensare i 5 μL necessari per ogni campione.

Ad esempio, se devo retrotrascrivere 20 campioni di RNA, preparerò un unico mix. Come? Semplice, basta moltiplicare il volume di buffer e di enzima necessario per una reazione per il numero di campioni totali. Consideriamo che preleveremo dallo stesso mix 5 μL per 20 volte e che ad ogni prelievo è possibile perdere un piccolissimo volume del mix: questo errore inevitabile va considerato, infatti solitamente il mix viene preparato per almeno uno o due campioni in più. Quando andremo a fare i nostri calcoli non moltiplicheremo per 20, ma per 22, così saremo certi che ogni campione di RNA riceverà i suoi 5 μL necessari per la reazione di retrotrascrizione.

Cosa abbiamo sul bancone? Il nostro RNA, diluito con acqua nuclease-free affinché ne venga retrotrascritto 1 μg, e il nostro mix di reazione contenente enzima e buffer. Ricordiamo che la reazione viene eseguita in 20 μL, la quantità di mix da aggiungere per ogni campione è di 5 μL, per cui i restanti 15 μL sono costituiti dall’RNA e dall’acqua.

Una volta aggiunto il mix all’RNA bisogna dolcemente risospendere la soluzione (attenzione a non formare bolle!) e procedere con il protocollo di reazione: le eppendorf o le strip contenenti la nostra reazione vengono inserite all’interno di un termociclatore. Secondo questo kit, il primo step, definito “priming”, si svolge a 25 °C per 5 minuti, è il momento in cui il primer lega il filamento di RNA dando l’innesco per la reazione di retrotrascrizione. Successivamente seguono 20 minuti a 46 °C, in cui avviene la vera e propria reazione di retrotrascrizione e la sintesi del cDNA.  Segue 1 minuto a 95 °C necessario ad inattivare l’enzima e a fermare la reazione.

Il cDNA così ottenuto può essere conservato a + 4 °C, come sempre si consiglia di conservarlo succesivamente a – 20 °C per preservarne la struttura nel tempo.

Conclusioni

La tecnica di retrotrascrizione è l’esempio di come i ricercatori possano utilizzare i meccanismi biologico-molecolari propri degli esseri viventi, anche di diverse specie, come strumenti di ricerca per approfondire le conoscenze sul mondo che ci circonda. Ogni scoperta può essere l’input per una successiva. La retrotrascrizione ha permesso e permette di analizzare i vari profili di espressione che sono alla base anche dei più “semplici” meccanismi biologici.

Fonte: Brock. Biologia dei microrganismi. Microbiologia generale, ambientale e industriale. 14/Ed. Pearson.

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