L’elettrofisiologia è quella branca che si occupa di studiare le proprietà e condizioni elettriche che caratterizzano i diversi tipi cellulari; ogni cellula, infatti, presenta un potenziale elettrico di membrana. Questo potenziale elettrico è alla base della trasmissione dei segnali nervosi e muscolari. Il potenziale di membrana è determinato dalla diversa permeabilità della membrana stessa a specie ioniche presenti a diverse concentrazioni ai suoi due lati.
Potenziale elettrico di membrana
Natura elettrogenica della pompa sodio/potassio
Il fatto che la pompa sodio/potassio muova 3 ioni sodio verso l’esterno e 2 ioni potassio verso l’interno della cellula significa che al netto, una carica positiva viene portata all’esterno della cellula ad ogni ciclo. Per questo motivo la pompa sodio/potassio è detta elettrogenica, in quanto essa determina la formazione di un potenziale elettrico attraverso la membrana cellulare. Questo significa che all’esterno della membrana vi sarà un accumulo di cariche positive, mentre all’interno di cariche negative. Questa configurazione fa sì che sia possibile associare la membrana plasmatica, per le sue proprietà elettriche, ad un condensatore.
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Potenziale elettrico
La presenza di un potenziale elettrico attraverso la membrana fa sì che le cariche elettriche degli ioni causino un loro spostamento attraverso di essa a prescindere dalla loro concentrazione. Se, per esempio, consideriamo degli ioni carichi positivamente, essi tenderanno a spostarsi verso il lato della membrana che presenta un potenziale negativo, aumentando la concentrazione di questi ioni in questo compartimento. A questo punto la differenza di concentrazione spingerà gli ioni nella direzione opposta. Quando questa forza sarà sufficientemente alta, essa controbilancerà del tutto lo spostamento dovuto al potenziale elettrico.
Come calcolare il potenziale elettrico
Il potenziale elettrico, o forza elettromotrice, in grado di bilanciare la differenza di concentrazione di un qualunque ione univalente viene determinato attraverso l’equazione di Nernst. Essa dipende dal rapporto delle concentrazioni del suddetto ione tra un lato e l’altro della membrana plasmatica. Tuttavia, questa equazione funziona solo se si considera una membrana permeabile ad un solo ione. Questo non è chiaramente il caso delle condizioni fisiologiche, di conseguenza, quando una membrana è permeabile a diversi ioni il potenziale di diffusione viene calcolato usando l’equazione di Goldman.
Essa dipende da 3 fattori:
- la polarità della carica di ciascuno ione
- la permeabilità della membrana ad ognuno di essi
- le rispettive concentrazioni interne ed esterne.
Come si misura il potenziale di membrana
Per misurare il potenziale di membrana si utilizzano 2 elettrodi ed un voltmetro. Un elettrodo, una pipetta dal diametro di circa un micron, viene fatto passare attraverso la membrana e all’interno della cellula; l’altro viene posizionato nel fluido extracellulare. Entrambi sono pieni di una soluzione elettrolitica e in questo modo il voltmetro può misurare la differenza di potenziale tra l’interno e l’esterno della membrana. Il potenziale di membrana delle fibre nervose (assoni) a riposo è di circa -90 millivolt (mV), cioè 90 mV più negativo rispetto all’esterno della fibra.
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Cosa contribuisce alla formazione del potenziale di riposo?
- Il potenziale di diffusione del potassio, il quale tende ad uscire dalla cellula; calcolato a -94 mV con l’equazione di Nernst.
- La diffusione del sodio attraverso la membrana verso l’interno della cellula. La membrana è 100 volte più permeabile al potassio che al sodio quindi, secondo l’equazione di Goldman, il risultato tra questi 2 componenti è di -86 mV.
- Il ruolo della pompa sodio/potassio: come precedentemente detto la pompa ha natura elettrogenica e contribuisce con -4 mV al totale ottenendo così i -90 mV finali.
Il metodo del patch-clamp
Il metodo del patch-clamp è utilizzato per registrare flussi di corrente ionici attraverso singoli canali di membrana. Viene utilizzata una pipetta con un diametro di 1 o 2 micron che viene poggiata contro la membrana cellulare. A seguito di una leggera suzione la membrana cellulare presente a livello della punta della pipetta viene sigillata contro di essa. Questo è il cosiddetto “patch” di membrana ed è il flusso che passa attraverso di esso che può essere registrato. I patch possono essere così piccoli che in corrispondenza di essi si trovi un singolo canale di membrana. Il voltaggio tra i 2 lati della membrana può essere manipolato così come le concentrazioni di ioni nei fluidi all’interno e all’esterno della pipetta, in questo modo possono essere determinate le caratteristiche di trasporto e di gating del canale studiato.
Potenziale d’azione nel sistema nervoso
I segnali nervosi sono trasmessi tramite potenziali d’azione, cioè rapidi cambiamenti del potenziale di membrana che si diffondono rapidamente lungo la membrana delle fibre nervose fino a raggiungerne la fine. Ogni potenziale d’azione comincia con un improvviso passaggio del potenziale di membrana da negativo a positivo e termina altrettanto rapidamente tornando ai normali valori negativi [Fig 1].
Fasi del potenziale
Fase di riposo: in questa fase il potenziale di membrana è quello di riposo (-90 millivolt per le fibre nervose, -70 mV per i neuroni). In queste condizioni si dice che la membrana è polarizzata.
Fase di depolarizzazione lenta: a questo punto, a seguito di uno stimolo, la membrana diventa permeabile agli ioni sodio per via dell’apertura di canali sodio voltaggio-dipendenti. Questo permette l’ingresso di ioni sodio ed una depolarizzazione fino ad un valore soglia di circa -45/-50 mV. Qualsiasi stimolo che non riesca a superare questo valore soglia non genererà un potenziale d’azione.
Fase di depolarizzazione rapida: raggiunto questo valore soglia nuovi canali sodio si aprono, permettendo al potenziale di membrana di raggiungere valori positivi (fino a +35 mV nelle fibre nervose di maggiori dimensioni).
Fase di ripolarizzazione: raggiunto il picco di depolarizzazione, i canali per il sodio si chiudono mentre si aprono quelli per il potassio. A questo punto, una rapida diffusione di potassio verso l’esterno ripolarizza la membrana a valori negativi.
Fase di iperpolarizzazione postuma: durante questa breve fase i canali per il sodio sono completamente chiusi quindi il potenziale di membrana si assesta attorno al valore del potenziale elettrico del potassio (-94 mV), per poi tornare ai valori normali man mano che i canali per il sodio tornano al loro stato di riposo.
Ciclo di Hodgkin
Il processo di formazione del potenziale d’azione è un esempio di feedback positivo in quanto l’ingresso di sodio nella cellula e la depolarizzazione della membrana fanno sì che sempre più canali per il sodio si attivino, aumentando l’ingresso di sodio e quindi la depolarizzazione stessa. Il processo che si innesca una volta raggiunto il valore soglia è anche definito ciclo di Hodgkin.
Periodo di refrattarietà
La fase di ipepolarizzazione, in cui i canali del sodio sono in uno stato di inattivazione, può anche essere definita come periodo refrattario. Si parla di periodo refrattario assoluto quando a prescindere dallo stimolo ricevuto i canali non possono essere attivati e quindi non si potrà generare alcun potenziale d’azione. Si parla invece di periodo refrattario relativo quando i canali del sodio iniziano a riattivarsi e la cellula può rispondere agli stimoli ma in maniera attenuata. Saranno necessari quindi stimoli di intensità maggiore per riuscire a superare la soglia.
Ristabilire i livelli fisiologici di sodio e potassio
Ciascun segnale d’azione riduce leggermente le differenze di concentrazione di ioni sodio e potassio tra interno ed esterno della membrana. Di conseguenza, per riportare questi valori a quelli di riposo è necessaria l’attivazione della pompa sodio/potassio per “ricaricare” l’assone ed evitare l’annullamento dei gradienti di concentrazione sul lungo termine. Tuttavia, questo processo richiede un dispendio energetico sottoforma di ATP.
Propagazione del potenziale d’azione
Un potenziale d’azione provocato in qualsiasi punto di una membrana eccitabile si diffonde alle porzioni adiacenti della membrana, determinando una propagazione del segnale. Nello specifico, le cariche positive della depolarizzazione tendono a creare dei circuiti locali di flussi di corrente verso le zone di membrana adiacenti in fase di riposo. Di conseguenza queste correnti, dette anche elettrotoniche, determinano l’apertura dei canali sodio voltaggio-dipendenti diffondendo il potenziale d’azione sia a monte che a valle del punto di eccitazione.
Per via del periodo di refrattarietà tuttavia, il potenziale d’azione può generarsi solo in zone dalle quali non è ancora passato (in direzione anterograda), dove cioè i canali sodio possono essere stimolati dalle correnti elettrotoniche. Questo processo di depolarizzazione lungo un assone è ciò che viene definito: segnale nervoso.
Velocità di propagazione del segnale nervoso
Per via delle sue caratteristiche, la velocità di diffusione di un segnale nervoso dipende dalla velocità ed efficienza con cui le correnti elettrotoniche depolarizzano la membrana. La corrente può fluire sia lungo il citoplasma delle fibre nervose che attraverso la membrana plasmatica, nonchè lungo il liquido extracellulare. Ciascuno di questi compartimenti presenta delle caratteristiche specifiche che determinano diversi valori di resistenza al flusso di corrente (il volume del liquido extracellulare è talmente più elevato di quello del citoplasma che la sua resistenza può essere tuttavia trascurata).
Allontanandosi dal sito di origine del segnale quindi queste correnti tendono a diminuire di intensità per via di una graduale dissipazione attraverso la membrana plasmatica. Essa costituisce un isolante imperfetto e quindi non può evitare piccole perdite lungo il tragitto.
Questo decadimento costante dipende da 2 fattori: una costante di spazio ed una costante di tempo.
Costante di spazio
La velocità del segnale è direttamente proporzionale alla costante di spazio, che rappresenta la distanza che il segnale può percorrere prima di decadere al 37% del suo valore iniziale. Questo valore quindi permette di capire la distanza che il segnale può percorrere prima di perdere efficacia. Esso viene calcolato sulla base della resistenza della membrana (o resistenza radiale) e del citoplasma (o resistenza longitudinale). Nello specifico, maggiore è la resistenza di membrana e minore quella citoplasmatica, maggiore sarà la costante di spazio, ergo più velocemente viaggerà l’impulso nervoso.
Costante di tempo
La velocità del segnale è invece indirettamente proporzionale alla costante di tempo, cioè il tempo necessario affinchè il potenziale di membrana raggiunga il 63% del suo valore finale (intorno ai 10 ms in molte cellule nervose).
Conduzione saltatoria
La resistenza citoplasmatica diminuisce all’aumentare del diametro dell’assone. Quindi aumentando la dimensione dell’assone si può aumentare la costante di spazio e di conseguenza la velocità di trasmissione dei segnali nervosi. Questa tecnica è perlopiù scelta negli invertebrati, dove si trovano assoni dal calibro molto elevato. Un esempio tipico è quello dell’assone gigante di calamaro, il quale può raggiungere fino ad 1 millimetro di diametro ed è per questo stato largamente usato in diversi esperimenti di elettrofisiologia.
Nei vertebrati la velocità di conduzione del segnale nervoso è di circa 0,25m/sec in piccole fibre e di 100m/s nelle grandi fibre. Questa enorme differenza non è però determinata semplicemente dalle diverse dimensioni tra le 2 categorie. Per poter aumentare la velocità di conduzione infatti, viene utilizzata una strategia differente, cioè quella della conduzione saltatoria.
Fibre mieliniche
Il processo che permette di velocizzare la conduzione del segnale nervoso è il cosidetto processo di mielinizzazione delle fibre nervose. Gli assoni sono cioè avvolti da una guaina mielinica che permette di aumentare le proprietà isolanti della membrana assonica e quindi di aumentare la resistenza radiale. Ciò comporta un aumento della costante di spazio e quindi della velocità di conduzione.
Processo di mielinizzazione
La guaina mielinica è costituita da specifiche cellule gliali: gli oligodendrociti nel sistema nervoso centrale e le cellule di Schwann nel sistema nervoso periferico. In entrambi i casi il processo avviene nel seguente modo: un assone affonda nel citolasma di una cellula di Schwann (o di un oligodendrocita) ed essa compie numerosi giri attorno all’assone stesso, avvolgendosi a spirale. Il citoplasma di queste cellule viene man mano eliminato venendosi a formare molteplici strati di sovrapposizione di membrana plasmatica. La peculiarità di questa membrana è la sua alta concentrazione di lipidi che la rende un eccellente isolante elettrico. Tra ogni manicotto mielinico ed il successivo, ciascuno costituito da una singola cellula di Schwann, rimangono delle piccole aeree non isolate, di 2-3 micron, dove si puo avere flusso di ioni attraverso la membrana dell’assone. Queste zone, ricche di canali ionici voltaggio-dipendenti, sono chiamate nodi di Ranvier.
Come funziona la conduzione saltatoria?
Questo implica che nelle fibre nervose mieliniche il potenziale d’azione si puo generare solo a livello dei nodi di Ranvier, di conseguenza la trasmissione del segnale è detta saltatoria in quanto l’impulso “salta” da un nodo di Ranvier al successivo. La propagazione del segnale avviene come descritto precedentemente, con la differenza che le correnti elettrotoniche generate scorrono rapidamente e con deboli perdite lungo il tratto mielinico. In questo modo si aumenta la velocità di conduzione fino a 50 volte. Un ulteriore vantaggio dato dalla conduzione saltatoria è la diminuzione del dispendio energetico necessario alla conduzione del segnale, in quanto si ha una perdita di ioni nettamente inferiore.
Referenze
- Fisiologia. Molecole, cellule e sistemi, a cura di Egidio D’Angelo e Antonio Peres – Edi ermes
- Textbook of Medical Physiology, thirteenth edition, Guyton and Hall – Elsevier
