Il sequenziamento del DNA è risultato uno strumento fondamentale per la diagnosi delle malattie genetiche già a partire dalla sua invenzione con il metodo Sanger nel 1977. Lo sviluppo delle metodologie di sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS) ha permesso di superare le limitazioni del sequenziamento Sanger, consentendo di ottenere un numero molto maggiore di dati in meno tempo e con costi minori.

Ciò offre una concreta possibilità di ricevere una diagnosi soprattutto per quei pazienti la cui mutazione si trova in geni nuovi, cioè geni non precedentemente associati a patologie e quindi non individuabili con i metodi di dagnosi standard. La possibilità di ricevere una diagnosi molecolare si traduce, a sua volta, nella speranza di poter ricevere una cura con tecniche avanzate come l’editing genomico.

Cos’è il sequenziamento del DNA e le sue origini

Con il termine “sequenziamento del DNA” ci si riferisce alla possibilità di “leggere” la sequenza del nostro DNA, determinando cioè l’ordine con cui si presentano le quattro basi azotate (adenina, timina, citosina e guanina). Le origini del sequenziamento del DNA risalgono alle prime tecniche elaborate nel 1977 da Maxam-Gilbert e da Sanger. Queste tecniche operano frammentando il DNA in maniera controllata per rivelare l’ordine in cui i nucleotidi vengono rimossi, che dipende dall’ordine che avevano all’interno della molecola di DNA.

Il sequenziamento Sanger, per la sua maggiore semplicità e sicurezza, si è poi diffuso in tutti i laboratori di genetica e biologia molecolare del mondo. Nonostante l’importanza rivestita al momento della sua diffusione, questa tecnica presenta comunque notevoli limitazioni riguardanti:

• Scalabilità (cioè la capacità di un test di essere utilizzato in situazioni e casistiche diverse senza perdere affidabilità e accuratezza)
• Velocità
• Risoluzione
• Costi

Per questo, il metodo Sanger è stato a oggi in gran misura sostituito dalle nuove tecniche di Next Generation Sequencing. Viene ancora utilizzato principalmente come metodo d’elezione per la validazione di varianti individuate con i metodi di sequenziamento di nuova generazione. Infatti, una volta individuata una probabile variante con l’NGS, la sua effettiva presenza nel DNA del paziente (ed eventualmente in altri membri della famiglia) deve essere comunque verificata con metodo Sanger.

La rivoluzione dei metodi di sequenziamento: l’avvento del Next Generation Sequencing

Nell’ultimo decennio, l’avvento delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione ha permesso di superare gli evidenti limiti dei metodi di sequenziamento precedenti. Il Next Generation Sequencing permette, infatti, di processare milioni di frammenti di DNA (noti come reads) in parallelo. Poter leggere in parallelo le sequenze di DNA ha permesso di abbattere i costi e i tempi di attesa a fronte di una velocità molto maggiore dell’analisi, che consegna un output di dati molto maggiore in molto meno tempo.

Il Next Generation Sequencing nella diagnosi delle malattie genetiche

Queste metodiche hanno rivoluzionato l’approccio diagnostico delle malattie genetiche, grazie alla possibilità di analizzare rapidamente e con alta precisione e sensibilità vaste porzioni di DNA, fino ad arrivare anche a leggere interi genomi. Questo risulta ulteriormente utile per le malattie genetiche rare (con incidenza nella popolazione pari o inferiore allo 0,05%), sulle quali spesso si hanno conoscenze limitate che rendono la diagnosi ancora più ostica.

Le tecniche di next generation sequencing maggiormente utilizzate nella diagnostica sono:

• Il sequenziamento di pannelli di geni (targeted sequencing)
• Il sequenziamento dell’intero esoma (Whole Exome Sequencing, WES)
• Il sequenziamento dell’intero genoma (Whole Genome Sequencing, WGS)

Queste si utilizzano nel processo diagnostico seguendo un ordine che vede progressivamente aumentarne la complessità e il costo.

Il sequenziamento di pannelli di geni

I pannelli di geni sono il metodo diagnostico d’elezione in questo ambito, e sono pertanto i primi a essere utilizzati. Permettono di sequenziare una lista predefinita di geni e di regioni non codificanti, precedentemente selezionati in quanto noti per contenere varianti responsabili delle patologie di cui si vuole effettuare la diagnosi. L’utilizzo dei pannelli per il sequenziamento è possibile per diverse malattie genetiche, tra le quali:

• Immunodeficienze
• Cecità
• Sordità
• Disordini mitocondriali
• Disordini renali
• Disordini neurologici

Tuttavia, con test di questo tipo è possibile analizzare solo geni che sono già noti per causare patologie, lasciando senza diagnosi tutti quei pazienti i cui geni mutati sono geni nuovi e che quindi non possono essere inclusi nei pannelli. Inoltre, presentazioni atipiche della patologia possono prevenire i clinici dallo scegliere il pannello appropriato rendendo ancora più difficile la diagnosi.

Il Sequenziamento dell’intero esoma (WES)

Permette di sequenziare tutte le regioni codificanti per proteine del genoma umano, consentendo l’identificazione di varianti esoniche e di varianti di splicing. In questo modo risulta pertanto possibile anche identificare varianti in nuovi geni mai associati prima a patologie e, quindi, non inclusi nei pannelli. Il fatto che l’85% delle mutazioni responsabili di patologie Mendeliane (cioè patologie monogeniche, causate da un unico gene) sono situate nelle regioni codificanti del DNA spiega facilmente come il sequenziamento dell’intero esoma sia, spesso, sufficiente a garantire la diagnosi.

Tuttavia, non sempre il WES permette di arrivare effettivamente a individuare il gene. Infatti, può accadere che la mutazione non si trovi a livello di una regione codificante, o che ci si trovi in presenza di un’estesa variante strutturale (alterazione nucleotidica di grandi dimensioni) o di una inserzione-delezione che non è possibile analizzare con il sequenziamento dell’esoma.

Sequenziamento dell’intero genoma (WGS)

Questa tecnica permette potenzialmente di identificare tutte le varianti responsabili di malattia. Infatti, mentre il WES copre solo il 2% del genoma, quello che corrisponde alla parte codificante, il WGS può individuare anche:

• Varianti non codificanti
• Indel (cioè inserzioni o delezioni di nucleotidi a livello di una sequenza di DNA, che ne fanno variare la lunghezza totale)
• Lunghe regioni ripetitive
• Interi riarrangiamenti cromosomiali

Ovviamente, il WGS genera una mole di dati sponenzialmente più grande rispetto al WES. Di conseguenza è un esame più costoso e più complesso da analizzare e da interpretare.

Una criticità etica: gli incidental findings

Con il termine incidental findings ci si riferisce a dati genetici, inerenti alla salute dell’individuo e/o a scelte riproduttive ed esistenziali, riscontrati in maniera accidentale mentre si ricercavano altre informazioni. L’utilizzo nel campo diagnostico e di ricerca delle tecniche di Next Generation Sequencing, e l’enorme mole di dati che queste tecniche generano, ha reso sempre maggiore la probabilità di trovare questi “risultati accidentali”. La difficoltà è quindi, dal punto di vista etico, decidere quando, come e soprattutto se comunicare alla persona interessata dall’analisi, di aver trovato tale risultato accidentale, considerando tutte le implicazioni psicologiche che tale notizia potrebbe avere.

La Commissione per l’Etica e l’Integrità nella Ricerca del CNR, ha indicato i seguenti criteri da soddisfare per decidere di rivelare la scoperta effettuata:

• Validità analitica: i risultati ottenuti devono essere accurati e affidabili
• Rilevanza clinica o esistenziale: la scoperta fatta accidentalmente deve avere rilevanza dal punto di vista clinico, e/o avere implicazioni importanti per le scelte riproduttive o esistenziali
• Azionabilità clinica o esistenziale: il risultato deve poter influenzare le decisioni cliniche e terapeutiche e/o le scelte di vita della persona e della sua famiglia (ad esempio con le disposizioni testamentarie)

Non si dovranno invece comunicare:

• Scoperte che includono VUS (variants of uncertain significance), cioè varianti di cui non sia nota la rilevanza clinica
• Varianti in geni in cui la correlazione con la patologia in questione non sia ben definita in letteratura
• Varianti relative a condizioni non gravi.

L’obiettivo di questi criteri è guidare il medico nel compiere la miglior decisione nell’interesse del benessere psicofisico del paziente. Resta in ogni caso alla persona interessata decidere di voler o meno conoscere eventuali incidental findings, secondo il “diritto di sapere e diritto di non sapere”.

L’importanza di ricevere una diagnosi molecolare grazie al Next Generation Sequencing

Riuscire a individuare il gene mutato responsabile della patologia in un paziente è certamente importante per comprendere meglio le basi biologiche della malattia stessa, ma non solo. Nell’era del genome editing infatti, riuscire a individuare la mutazione che causa la malattia nel singolo paziente, potrebbe presto significare poterla anche curare. L’editing genomico permetterebbe infatti di correggere la mutazione, ripristinando la normale sequenza di DNA. E se questa terapia potrebbe offrire quindi speranza ai pazienti malati in tutto il mondo, il primo passo per poterla effettuare è proprio trovare la mutazione responsabile della patologia da curare.

Inoltre, oltre al risvolto strettamente terapeutico, è da considerare anche il fatto che una volta scoperto un nuovo gene responsabile di quella patologia, esso può essere aggiunto al set di geni che vengono analizzati in maniera routinaria all’interno dei pannelli, implementando quindi anche la metodica diagnostica standard.

Alla luce di quanto riportato, appare quindi chiara l’importanza delle metodiche di Next Generation Sequencing per la ricerca, la diagnosi e la terapia delle malattie genetiche.

Referenze