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Cos’รจ la crio-microscopia elettronica?

Il Premio Nobel per la chimica 2017 รจ andato agli scienziati che hanno messo a punto la Crio-Microscopia elettronica, una tecnica rivoluzionaria che ci ha permesso di vedere in 3D le molecole biologiche. L’Accademia Svedese ha assegnato allo svizzero Jaques Dubochet (Universitร  di Losanna), al tedesco Joachim Frank (Columbia University) e allo scozzese Richard Henderson (Medical Research Council Laboratory) il premio di circa 940 mila euro per gli studi compiuti su un nuovo e rivoluzionario metodo per vedere le molecole biologiche. Fin dagli anni ’70, fino ad oggi, i tre ricercatori hanno studiato e perfezionato la tecnica della microscopia per poterla applicare anche alle molecole biologiche, che fino a quel momento era impossibile visualizzare con i normali microscopi elettronici.

Queste molecole, infatti, sono particolarmente sensibili al fascio di elettroni usato per poter osservare ingrandimenti di molecole inorganiche o piccole molecole organiche (la lunghezza d’onda degli elettroni รจ infatti minore di quella della luce e permette quindi di osservare oggetti molto piรน piccoli rispetto a quelli osservabili con un microscopio ottico) ed era sempre stato difficile o impossibile impedirne la degradazione.

La Crio-Microscopia, invece, sfrutta le basse temperature raggiunte da un solvente per congelare le molecole biologiche e quindi riuscire a vederne la struttura complessa.

Richard Henderson e gli studi sulla Rodopsina

Le molecole biologiche non erano un materiale semplice con cui avere a che fare: un fascio di elettroni sufficientemente potente da rendere l’immagine di una risoluzione adeguata, infatti, distrugge il campione, inoltre le condizioni di vuoto spinto necessarie al funzionamento dello strumento degradano le proteine e molte altre molecole biologiche.

Struttura della Rodopsina batterica pubblicata da Henderson

Fu Henderson, intorno alla metร  degli anni ’70, a proporre dei primi metodi per ovviare questo ostacolo.

Il suo metodo prevedeva l’utilizzo di una soluzione di glucosio che avrebbe avuto la funzione di proteggere il campione sia dal vuoto che dal fascio di elettroni sparato dallo strumento. Grazie a questi accorgimenti riuscรฌ per la prima volta a ottenere la struttura tridimensionale della Rodopsina, una proteina transmembrana che si trova nelle cellule fotosensibili, come ad esempio i bastoncelli della retina e non solo.

Negli anni successivi, Henderson riuscรฌ a perfezionare enormemente il suo metodo, fino a pubblicare, nel 1990, la struttura della Rodopsina con una risoluzione che arrivava fino a 3 Angstrom (1ย ร… = 0,1 nm ).

Pur rappresentando un enorme successo, il metodo utilizzato da Henderson perรฒ non poteva essere applicato a tutte le molecole biologiche, in quanto non era adatta a quelle molecole solubili in acqua. Era necessario, quindi, mettere a punto una metodologia che potesse essere applicata a tutte le molecole biologiche.

Jacques Dubochet: l’acqua vetrificata

Molti ricercatori avevano tentato di congelare i campioni disciolti in acqua per poterne osservare la struttura, ma il reticolo cristallino del ghiaccio aveva l’effetto di deviare il fascio di elettroni rendendolo cosรฌ inutilizzabile.

Fu Debochet a trovare la soluzione del problema: lui ed il suo team di ricercatori iniziarono a congelare rapidamente l’acqua, variando la velocitร  e la temperatura di congelamento per ottenere diverse strutture cristalline.

Quella che si rivelรฒ piรน adatta รจ la struttura detta vetrosaย in cui le molecole d’acqua, a causa della velocitร  di raffreddamento, mantengono una struttura disordinata simile a quella che si avrebbe allo stato liquido, e cosรฌ facendo il fascio di elettroni non viene deviato come accadrebbe invece con un ghiaccio dalla struttura piรน regolare.

Strutture ottenute da Dubochet: a) proteina che governa i ritmi circadiani b) sensore uditivo c) virus zika (Credit:ย Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences)

Dubochet riuscรฌ a ottenere immagini molto dettagliate vetrificandoย delle gocce d’acqua (in cui era stato sciolto il campione) in etano liquido congelato alla temperatura di -196ยฐC. Un’ulteriore perfezionamento del metodo si ottenne portando la temperatura di congelamento vicina a quella dell’Azoto liquido ( minore di -195,82ยฐC).

Frank e la prima immagine tridimensionale di un ribosoma

Non restava che trovare un metodo per rendere questo metodo applicabile piรน diffusamente possibile.

Joachim Frank perรฒ riuscรฌ ad effettuare, dapprima in linea teorica e poi in pratica, il grande salto necessario affinchรฉ la crio-microscopia elettronica fosse davvero un punto di svolta nella ricerca scientifica su larga scala.

Biofisico tedesco e naturalizzato americano, Frank sviluppรฒ un algoritmo matematico che, sfruttando la funzione denominata Trasformata di Fourier, otteneva immagini tridimensionali ad alta risoluzione da immagini bidimensionali a risoluzione minore.

struttura di un ribosoma ottenuta tramite crio-microscopia elettronica (Credit:ย Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences)

L’algoritmo da lui sviluppato permetteva di identificare schemi e pattern ricorrenti in diverse immagini, fino a rendere il risultato finale incredibilmente nitido, con una risoluzione che arrivรฒ infine a quella di un singolo atomo.

Utilizzando il metodo di Dubochet e grazie al suo algoritmo, Frank pubblicรฒ riuscรฌ a ottenere una definizione di 40ย ร….

Negli ultimi anni la tecnica messa a punto tramite il lavoro dei tre scienziati ora premio Nobel รจ stata sempre piรน perfezionata, anche grazie all’avanzamento tecnologico che ha permesso di avere rilevatori elettronici incredibilmente precisi, tanto che ormai la risoluzione ottenibile รจ quella del singolo atomo. Nel 2013 si รจ infine arrivati alla prima risoluzione della struttura molecolare di un ribosoma.

Grazie al perfezionamento e alla diffusione della crio-microscopia elettronica la biochimica ha potuto, e potrร  ulteriormente ottenere straordinari risultati, in quanto rende possibile osservare processi chimici fino a poco tempo fa impossibili da studiare, perchรฉ troppo veloci e su scala atomica.

Bibliografia

  • HENDERSON, R., et al. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy. Journal of molecular biology, 1990, 213.4 899-929.
  • TALMON, Yeshayahu. Radiation damage to organic inclusions in ice. Ultramicroscopy, 1984, 14.3 305-315.
  • VINOTHKUMAR, Kutti R.; HENDERSON, Richard. Single particle electron cryomicroscopy trends, issues and future perspective. Quarterly reviews of biophysics, 2016, 49.
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