Crispr/Cas9 si “evolve”: nasce evoCas9

Crispr/Cas9 è la forbice molecolare che negli ultimi anni ha rivoluzionato la biologia. Ma non è ancora perfetta e sono in corso numerose ricerche per renderla quanto più precisa possibile. E’ tutta italiana la scoperta di una versione “evoluta” del sistema, evoCas9, che si è dimostrata quasi impeccabile nei test. Per realizzarla è stato usato un approccio di tipo evoluzionistico.

Cosa è e come funziona Crispr/Cas9?

Ripassiamolo insieme! Anzitutto, è una tecnologia recente, messa a punto nel 2012, e non è stato solo merito nostro: ci siamo ispirati a una componente del sistema immunitario dei batteri, che usano per difendersi dai virus. Le proteine Cas “copiano e incollano” una parte del genoma del virus nel locus Crispr del cromosoma batterico, così da mantenerlo in memoria e neutralizzarlo rapidamente. Il sistema sintetizza una copia esatta del frammento genetico del virus precedentemente incorporato, ma in formato RNA, che si associa a una proteina chiamata Cas9, un enzima che taglia il DNA: il filamento di RNA guida la proteina Cas9 esattamente al virus, che soccombe sotto i colpi dell’implacabile forbice.

evoCas9
Fig,1 Il complesso Cas9 è guidato dal filamento di RNA al bersaglio virale, tagliandone i frammenti di DNA e fermando l’infezione.

I ricercatori hanno ottimizzato il sistema per modificare il DNA con una precisione impensabile fino a pochi anni fa. La proteina Cas9 viene associata a un filamento di RNA che funziona da “navigatore” e la dirige nel punto del genoma che si vuole modificare; Cas9 taglia e la cellula ripara il DNA utilizzando come stampo il filamento complementare (sappiamo infatti che il DNA è una doppia elica e che anche durante la replicazione ciascuno dei due filamenti fa da stampo per la sintesi dell’altro, grazie alla complementarietà delle basi azotate). Così facendo, possiamo sostituire singole “lettere” nel DNA, correggendo ad esempio le mutazioni che conducono a una malattia, o semplicemente spegnere i geni dannosi.

Verso una forbice sempre più precisa…e made-in-Italy!

Le premesse sono buone, ma è ancora presto per pensare a un suo regolare utilizzo terapeutico. Crispr/Cas9 è uno strumento di precisione, ma anche i migliori possono sbagliare e una delle sue grandi limitazioni è il rischio di attività non specifica. Purtroppo in questo caso l’errore non è ammesso, poiché tagliare il genoma “a casaccio” potrebbe essere estremamente pericoloso per il paziente.

I ricercatori dell’Università di Trento hanno perfezionato ancora il sistema, riducendone al minimo l’attività non specifica. La sua performance è stata brillante, anche nel lungo termine. Come ci sono riusciti?

Le possibili strategie erano due: migliorare il “navigatore” a RNA o ottimizzare la “forbice” Cas9. Loro hanno optato per la seconda, seguendo un approccio di tipo evoluzionistico…in provetta! Il metodo si chiama “evoluzione diretta” e viene usato per far evolvere le proteine verso uno scopo predefinito. Prima sono state generate numerose varianti della proteina Cas9 e poi assemblate nelle cellule di Streptococcus pyogenes. Gli scienziati hanno quindi messo su un sistema di screening per riconoscere visivamente le varianti più specifiche e selezionato solo i batteri che le avevano incorporate per un successivo round di mutagenesi, screening e selezione e così via. Hanno quindi mimato cosa succede in natura, ma ci hanno messo il loro zampino, dirigendo magistralmente l’evoluzione verso lo scopo desiderato.

Sono state quindi selezionate le varianti più specifiche e identificate le corrispondenti mutazioni. Le quattro migliori sono state combinate in un’unica proteina, generando evoCas9, un vero e proprio “bisturi” che si è distinto in tutti i test per accuratezza e specificità. Grazie a evoCas9, siamo sempre più vicini a operare sul DNA con la precisione di un chirurgo.

Fonte: Casini, A., et al. (2018). A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo
screening in yeast. Nature Biotechnol.

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